Generación de microportadores basados en mezclas de alginato de sodio y fibrinógeno

Los equivalentes tisulares son dispositivos artificiales que deben cumplir funciones similares a las del tejido que se quiere reemplazar. Muchas de las funciones de cada tejido son llevadas a cabo por células especializadas, cuyo crecimiento y supervivencia requiere de la existencia de un sustrato físico sobre el cual las células puedan anclarse. En el cuerpo humano tal sustrato es la matriz extracelular, pero en equivalentes tisulares al sustrato en mención usualmente se le denomina soporte. En el mercado ya existen múltiples equivalentes de piel que varían en el grado de complejidad, la presencia o no de células y el material de soporte empleado. El análisis de tales alternativas fue el objeto del capítulo 1, el cual presenta una revisión de la literatura en lo concerniente a equivalentes de piel comercialmente disponibles, sus pros y contras y las áreas que necesitan desarrollo. El plasma sanguíneo humano (PH) es un material ampliamente estudiado para fabricar soportes usados en ingeniería de tejidos gracias a su contenido de fibrinógeno, proteína que puede polimerizarse para formar una red de fibrina; tal red puede servir de albergue para células y promueve su proliferación, así como la síntesis de matriz extracelular. Además, es biocompatible, biodegradable y como puede obtenerse directamente de la sangre, hace posible su aplicación para trasplantes autólogos. Sin embargo, los geles de fibrina obtenidos a partir de PH son frágiles y difíciles de manejar, cualidades indeseables durante un procedimiento quirúrgico. Con el fin de mejorar las propiedades mecánicas de los geles obtenidos a partir de plasma sanguíneo humano, en el capítulo 2 del presente proyecto se evaluaron dos estrategias: la primera consistió en la combinación del PH con alginato de sodio, sustancia que tiene el mismo mecanismo de gelificación que el fibrinógeno (intercambio iónico con Ca+2); la segunda consistió en el aumento de la concentración de fibrinógeno mediante crioprecipitación de PH para formar plasma humano crioprecipitado (PHCC). Las propiedades mecánicas de los geles obtenidos usando ambas estrategias se determinaron mediante reología dinámica; los resultados muestran que los geles fabricados a partir de PHCC tienen una resistencia mecánica mayor que los fabricados a partir de alginato de sodio, a partir de mezclas de alginato y PH o a partir de mezclas de alginato y PHCC; en todos los casos, la resistencia mecánica fue mayor a mayores concentraciones de Ca+2. Las mejores propiedades mecánicas del gel de PHCC comparadas con las de PH, permiten sugerir su uso como material de soporte para ingeniería de tejidos sin las complicaciones adicionales de bioadhesion y biodegradabilidad que implica el uso de alginato. Sin embargo, el elevado tiempo de formación de gel con PHCC (de 10 a 30 min) y la necesidad de controlar la temperatura a valores muy específicos (37 ± 1 °C) dificulta su uso para la generación de soportes a alta velocidad con formas preseleccionadas, como las requeridas para formar las microesferas de las que se habla en el capítulo 3; en dicho caso, la mezcla PHCC+1% p/v de alginato de sodio resulta más conveniente. El desarrollo de equivalentes de piel con células requiere de la disponibilidad apropiada de estas últimas; el uso de células del propio paciente resultaría ideal para evitar cualquier problema de tipo imunológico. Desafortunadamente, en la mayoría de los casos la disponibilidad de células de piel del propio paciente es limitada como resultado de su condición patológica. Como alternativa, la expansión in vitro de una pequeña cantidad de células obtenidas del paciente mediante una biopsia podría vencer tal limitación, con tal que dicha expansión sea suficientemente rápida para proveer las células en un plazo prudente, de manera que el tratamiento llegue al paciente a tiempo para ayudarle en su recuperación. Para aumentar la velocidad de crecimiento se propone el uso de un biorreactor en donde se mantengan condiciones óptimas de pH, temperatura, oxígeno disuelto y nutrientes. Sin embargo, como ya se mencionó anteriormente, el cultivo de células de piel requiere de un soporte sólido con suficiente área superficial para alojar la cantidad total de células necesarias; este requerimiento puede ser provisto fácilmente mediante el uso de microportadores. La primera parte del capítulo 3 describe la elaboración de microportadores basados en una solución de alginato de sodio al 1% p/v, solución que se usó como modelo para realizar el montaje de una metodología experimental, para detectar y solucionar problemas y obtener unas condiciones finales de operación, sin gastar plasma humano. Esta metodología fue posteriormente aplicada a la elaboración de microportadores basados en mezclas de plasma sanguíneo crioconcentrado (PHCC) y alginato de sodio al 1% p/v. Finalmente, en el capítulo 4 se describe la metodología empleada para la evaluación de la adhesión celular y la citotoxicidad tanto en geles planos de PHCC y sus respectivas mezclas con alginato de sodio (al 0,5% y 1,0 % p/v), como en microportadores de PHCC y alginato de sodio al 1% p/v. La citotoxicidad de los materiales se determinó empleando el procedimiento descrito en la norma ISO 10993-5 para dispositivos médicos que involucra la elución de extractos del material y su aplicación en un cultivo celular seguida por conteo por MTT. Los resultados indican que ninguno de los materiales evaluados resultó citotóxico. Igualmente se realizó la evaluación de la adhesión celular empleando técnicas de microscopía confocal y fluorescencia, usando Hoechst® para la tinción de núcleos de fibroblastos murinos de la línea celular L929 y CFSE® para tinción de citoplasma; se encontró que las células se adhirieron en todos los soportes seleccionados, incluyendo los microportadores.Abstract. Tissue equivalents are artificial devices designed to do similar functions as to those of the biologic tissue they are intended to replace. Many of the tissue’s functions are accomplished by specialized cells whose growth and survival require a solid substrate for cell attachment. In the human body, such physiological substratum is the extracellular matrix, but in tissue equivalents it is named scaffold. There is a large variety of skin equivalents commercially available which vary in their complexity, presence or absence of cells and material used for scaffold. Chapter 1 deals with a literature review about skin equivalents, their pros and cons and areas requiring further research and development. Human plasma (PH) is a material widely studied as scaffold in tissue engineering due to its large content of fibrinogen, protein capable of polymerizing to make a fibrin net; such net can serve as shelter for cells, promoting their proliferation and extracellular matrix synthesis. In addition, fibrinogen is biocompatible, biodegradable and as it can be obtained directly from the own patient’s blood, it is suitable for autologous transplants. However, fibrin gels derived from PH are fragile and hard to handle, both undesirable characteristics along a surgical procedure. Chapter 2 illustrates two strategies to improve mechanical properties of fibrin gels from human plasma. The first strategy consisted on mixing PH with sodium alginate, substance that shares the same gelling mechanism as the fibrinogen (Ca+2 ionic exchange); the second one involved increasing the concentration of fibrinogen by cryo-precipitation of PH to form human plasma cryoprecipitate (PHCC). The mechanical properties of gels from both strategies were assessed by dynamic rheology; results indicate that gels made of PHCC have a larger mechanical strength compared to those made of sodium alginate, sodium alginate mixed with PH or sodium alginate mixed with PHCC. In every case, the larger the concentration of Ca+2, the larger was the mechanical strength of gels. The better mechanical strength of gels made only of PHCC compared to gels made of PH allow to suggest PHCC as a more suitable material to make scaffolds for tissue engineering, without the additional bioadhesion and biodegradability hurdles introduced by using alginate. However, the long time required for gelling (10 to 30 minutes) and the need to control very precisely the temperature (37 ± 1 °C), makes it very difficult to generate rapidly scaffolds with a preselected shape such as the microspheres described in chapter three. In such case, the mixture of PHCC with 1% w/v sodium alginate is more convenient. The development of cellular tissue equivalents requires wide availability of the proper cells; the usage of cells from the own patient would be ideal to avoid any kind of immunological response. Unfortunately, in most cases, there is a shortage of skin cells from the patient as a result of his/her pathological condition. As an alternative, in vitro expansion of a small amount of cells from a patient’s skin biopsy would provide enough cells for the equivalent as long as growth is fast enough that the skin equivalent can be provided to the patient on time to help to his/her recovery. To increase growth rate, the use of a bioreactor with optimally controlled conditions of pH, temperature, dissolved oxygen and nutrients is proposed. However, as mentioned before, skin cells require a solid substratum with enough surface area to provide anchorage for the amount of cells needed; such requirements could be easily provided by using microcarriers. The first part of chapter 3 describes the procedure for production of microcarriers from a solution of 1% w/v sodium alginate, used as a model solution for setting up the experimental methodology, detecting problems and solving them without wasting human plasma. Once standardized, the methodology was applied to the production of microcarriers based on a human plasma cryoprecipitate (PHCC) with 1% w/v sodium alginate. Finally, chapter 4 describes the methodology employed to assess citotoxicity from and cell adhesion to sheet gels made of PHCC or of PHCC mixed with 0,5% or 1% w/v sodium alginate, as well as to microcarriers made of PHCC mixed with 1% sodium alginate. Citotoxicity from gels was assessed following the procedure described in ISO 10993-5 for medical devices, which involves eluting an extract from the material, apply it into a cell culture and follow cell growth using MTT®. Results show no detectable cytotoxicity from any of the evaluated materials. Cell adhesion to gels was determined employing a confocal microscope and fluorescent dyes (Hoechst® for staining the nuclei of the murine fibroblastic L929 cell line and CFSE® for cytoplasm staining). It was found that cells adhered to all scaffolds, including microcarriers.Maestrí